Nacque il 7 luglio 1843 a Córteno, in Val Camonica, (allora provincia di Bergamo), dove il padre Alessandro, appena laureato, si era trasferito come medico condotto. Qui frequentò le scuole primarie e rimase per circa 15 anni. Durante la sua adolescenza studiò al liceo classico Ugo Foscolo a Pavia.
Terminati nel 1865 gli studi a Pavia con la laurea in medicina con una tesi "Sull'eziologia delle malattie mentali", discussa con Cesare Lombroso, entrò nel laboratorio istologico fondato da Paolo Mantegazza e diretto da Giulio Bizzozero, che fu suo primo maestro di ricerca. Per l'urgenza di trovare un lavoro sicuro, dovette però trasferirsi ad Abbiategrasso, dove aveva vinto il concorso per diventare primario del Pio Luogo degli Incurabili. Qui, nella cucina del suo modesto alloggio, allestì un laboratorio di istologia in cui, nel 1873, ideò la rivoluzionaria "Reazione Nera" (Metodo di Golgi). Questo metodo permetteva di colorare selettivamente le cellule nervose e la loro struttura organizzata: consentiva infatti la deposizione di argento metallico, da una soluzione del suo sale sulla superficie del neurone, evidenziandolo fin nei minimi particolari.
La sua scoperta fu conosciuta e apprezzata nella dovuta misura solo molti anni più tardi, soprattutto per merito del suo principale méntore, il patriarca della biologia ottocentesca Albert Von Koelliker.
Nel 1898, i suoi studi sulla cellula lo portarono alla scoperta dell'Apparato o Complesso di Golgi, uno dei componenti fondamentali della cellula, cinquanta anni prima dell'invenzione del microscopio elettronico, che la confermerà in pieno.
Fece anche importanti scoperte nel campo della malariologia, formulando la "Legge di Golgi". Nel 1885 dimostrò l'associazione tra periodicità delle febbri malariche e ciclo del plasmodio che ne era responsabile e che i due diversi tipi di febbre malarica, la terzana e la quartana, erano provocati da due specie di plasmodio diverse: P. vivax responsabile della terzana benigna e P. malariae responsabile della quartana. Nel 1889 dimostrò che gli attacchi febbrili si verificavano nel momento in cui gli sporozoiti (stadio del ciclo del plasmodio) rompevano i globuli rossi e si liberavano nel circolo sanguigno.
Scoprì anche le terminazione nervose dei tendini, dette corpuscoli del Golgi e compì importanti studi sui reni, la Corea di Huntington, i bulbi olfattori, ecc.
Trasferitosi a Pavia, città natale del padre, ottenne le cattedre ordinarie di Istologia e Patologia generale, indi fu nominato rettore dell'Università, incarico che ricoprì a più riprese (1893-1896 e 1901-1909). Si dedicò anche alla politica, o meglio all'amministrazione pubblica, ricoprendo tra le altre la carica di assessore all'igiene in Comune. Fu anche lungamente membro, e poi presidente, del Consiglio Superiore di Sanità. Propose la costruzione del nuovo Policlinico San Matteo e lottò strenuamente perché l'ateneo pavese mantenesse ed accrescesse il suo secolare prestigio.
Nel 1900 fu nominato da re Umberto I Senatore del Regno d'Italia per alti meriti scientifici, carica che mantenne fino alla morte nel 1926, avvenuta a Pavia, città in cui è sepolto insieme alla moglie, accanto alle tombe di Bartolomeo Panizza, suo professore, e Adelchi Negri, suo brillante allievo.
Fu insignito del Premio Nobel per la Medicina (precisamente "Medicina o Fisiologia") nel 1906 ex aequo con Santiago Ramón y Cajal, per gli studi sulla istologia del sistema nervoso: Golgi per la messa a punto della Reazione Nera, Cajal per le scoperte compiute grazie alla colorazione di Golgi. Cajal scoprì che i neuroni sono separati fisicamente l'uno dall'altro, ossia che interagiscono tra di loro non per continuità, bensì per contiguità attraverso la Sinapsi e che non sono uniti a formare un'unica rete sinciziale come sosteneva Golgi. Formulò quindi la legge cosiddetta della Polarizzazione dinamica.
In onore di Camillo Golgi, nel 1956 il paese natale (ultimo borgo dell'alta Valle Camonica, fra Edolo e il Passo dell'Aprica, che dopo l'unità d'Italia era tornato ad essere provincia di Brescia) cambiò il proprio nome da Córteno a Córteno Golgi. Nel 2006, centenario del Nobel, vi è stato inaugurato il Museo Golgi e dedicato un percorso tematico, anche Sentiero Mountain Fitness. Esso parte dal museo e arriva ad Aprica, percorrendo la Strada Valeriana tra prati e boschi, tragitto che Golgi amava percorrere durante la fanciullezza e, più tardi, nel corso dei suoi assidui soggiorni.
Gli è stato dedicato anche il cratere Golgi, situato sulla Luna.
